专题 基因工程与细胞工程二轮（李洪）

专题   基因工程与细胞工程

考纲要求

基因工程的诞生I

基因工程的原理和技术（PCR技术）II

基因工程的应用II

蛋白质工程I

植物的组织培养II

动物细胞培养与体细胞克隆II

细胞融合与单克隆抗体II

生命观念：

1.说出基因工程、细胞工程的基础理论

2.举例说出哪些技术催生了基因工程、细胞工程

科学思维、科学探究：

通过讨论、进展追踪等活动,提高处理资料,整理汇编,形成知识网络体系的能力。

社会责任：

认同基因工程、细胞工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。

认同科学、技术、社会的互动不断调整这人类与自然界的关系,推动着文明的进展。

[课前循图忆知]

重点、难点：

1、各技术的原理及操作过程

2、能够用原理分析实例，并设计实验

课时：4课时

教学方法：讲、练结合

教学过程：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

做真题·明方向

1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：

(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_______________________________________________________________(答出两点即可)。

(2)体外重组的质粒可通过Ca^2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。

(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。

解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca^2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。

答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶

2．(2018·全国卷Ⅱ节选)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1­GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：

(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是______________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证____________________。

(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。

(3)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。

解析：(1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1­GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1­GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1­GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。

答案：(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接　

(2)转录　翻译　(3)核DNA

理教材·固根基

学生活动：学生填写下图，教师点评，学生修正

1．比较记忆基因工程的三种工具(填表)

2．熟记基因工程的四个操作步骤(填图)

(1)目的基因的获取途径：

(2)基因表达载体(重组质粒)的构建：

①基因表达载体的组成：

②构建过程：

(3)将目的基因导入受体细胞：

(4)目的基因的检测与鉴定：

3．图解记忆蛋白质工程(填图)

练热点·会迁移

1．将某种植物中的耐盐基因，转入水稻细胞中培育出耐盐水稻新品系。如图是培育过程简图，请回答下列问题：

(1)阶段1的核心步骤是________________________，在这个过程中，理论上一般需用同种限制酶切割________个磷酸二酯键。

(2)为保证耐盐基因的正常转录，重组质粒b上耐盐基因的首端必须含有________，它是____________识别和结合的位点，尾端应含有________。

(3)由b到c常用的方法是________________，检测转基因植株是否培育成功的最简便方法是______________________________________________________________________。

(4)阶段2的培养基中除了必要的营养物质和琼脂外，还必须添加____________。

解析：(1)阶段1属于基因工程操作过程，基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。若用同种酶切割质粒和含目的基因的DNA片段，则在获取目的基因时，需要从目的基因两端切割，每个DNA分子有两条链，因此需要切开4个磷酸二酯键；对于质粒来说，只要切开一个切口即可，这样需切开2个磷酸二酯键，因此整个过程理论上一般需要切开6个磷酸二酯键。(2)转录是从基因的启动子部位开始的，因此必须保证基因首端有启动子。RNA聚合酶在转录时能识别并与启动子结合，在基因的尾端应有终止子，在此处RNA聚合酶与基因分离，转录停止。(3)常用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。本实验的目的是培育耐盐植物，因此可将转基因植物种植在盐碱地上观察其是否能正常生长。(4)在植物组织培养过程中，还必须在培养基中加入一定量的细胞分裂素和生长素。

答案：(1)基因表达载体的构建　6　(2)启动子　RNA聚合酶　终止子　(3)农杆菌转化法　将其种植在盐碱地上观察是否能正常生长(用一定浓度的盐水浇灌，观察其是否能正常生长)　(4)植物激素(细胞分裂素和生长素)

2．MAP30蛋白是一种能使Ⅰ型核糖体失活的蛋白质，存在于苦瓜果实和种子中。MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗艾滋病的功能，近年来引起人们的广泛关注。

(1)人们已经清楚MAP30蛋白的氨基酸序列，可以用____________方法获得MAP30蛋白的基因。利用PCR技术扩增该基因，PCR反应体系的主要成分应该包含：______________、__________、__________、__________、扩增缓冲液(含Mg^2＋)和水等。

(2)科学家用MAP30蛋白的基因与某种病毒的DNA构建基因表达载体，导入南瓜细胞中，在这个过程中，需要使用到的酶是__________________。为了避免出现“目的基因自我环化”、“目的基因在运载体上反向连接”的问题，请提出一种解决该问题的思路：_______________________________________________________________________。

(3)可用______________方法得到愈伤组织大规模生产MAP30蛋白，用______________方法检测MAP30的基因是否在南瓜果实中成功表达。

(4)弧菌是克氏原螯虾养殖中重要的致病菌，大规模暴发会给水产养殖带来巨大的经济损失。科研人员为了研究MAP30蛋白抗弧菌的效果，用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌，绘制弧菌生长曲线如图：

由图可以得出的结论是_____________________________________________________

________________________________________________________________________。

解析：(1)在已知氨基酸排列顺序的情况下，可以用化学合成的方法来合成相应的基因。PCR反应体系的主要成分应该包含进行DNA复制的原料即4种脱氧核糖核苷酸，进行复制的模板DNA，引物对和热稳定DNA聚合酶(Taq酶)等。(2)构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶，如果用两种限制酶分别去切割目的基因和运载体，这样目的基因两端的黏性末端和运载体两端的黏性末端都不同，就不会自身环化，也不会出现目的基因在运载体上反向连接的情况了。(3)愈伤组织的获得需要用植物组织培养技术。检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交方法。(4)分析此图，要分析在横坐标相同时不同曲线的差异。从图中曲线变化趋势可知，在相同的培养时间内，随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强。当MAP30蛋白浓度达到或高于500 g/mL时，弧菌生长完全被抑制。

答案：(1)化学合成(人工合成)　4种脱氧核糖核苷酸

　模板DNA　引物对　热稳定DNA聚合酶(Taq酶)　(2)限制酶、DNA连接酶　分别使用两种限制酶去剪切目的的基因和运载体　(3)植物组织培养　抗原—抗体杂交　(4)随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强；当MAP30蛋白浓度达到或高于500 g/mL时，弧菌生长完全被抑制

考点二　细胞工程

做真题·明方向

1．(2018·全国卷Ⅲ)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：

(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_______________________________________________。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目________(填“减半”“加倍”或“不变”)。

(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度________(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是________________________________________________________________。

(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目________(填“相同”或“不同”)，性染色体组合________(填“相同”或“不同”)。

解析：(1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。将重组细胞形成的早期胚胎移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞与提供细胞核的个体的体细胞的染色体数目相同。(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植获得克隆动物的难度明显高于胚胎细胞核移植。(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。

答案：(1)将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中　不变　(2)小于　胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易　(3)相同　不同

2．(2017·全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。

回答下列问题：

(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________________________________________________________。

(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。

(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。

①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO₂浓度，CO₂的作用是__________________。

②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。

解析：(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。(2)使用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、原料dNTP。(3)①T淋巴细胞浓度之所以不再增加，是因为细胞间出现接触抑制，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，需要对贴满瓶壁的细胞使用胰蛋白酶处理，然后分瓶培养，即对细胞进行传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO₂浓度，以维持培养液的pH。②据图分析，蛋白丙与对照接近说明B、D片段对于T淋巴细胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙对T淋巴细胞的增殖都有较大影响，甲、乙两种蛋白中共同的片段是C，所以缺少C片段会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。

答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG(TAC)，转录出的mRNA无起始密码子　(2)模板　dNTP(脱氧核苷酸)　(3)①进行细胞传代培养　维持培养液的pH　②C

理教材·固根基

学生活动：学生填写下图，教师点评，学生修正

1．比较记忆植物组织培养与动物细胞培养(填表)

2．理清克隆动物培育流程(填图)

3．比较记忆植物体细胞杂交与动物细胞融合(填表)

4．准确记忆单克隆抗体的“一过程两特点”(填空)

(1)制备过程：

(2)单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高。

练热点·会迁移

1．回答下列有关动物细胞培养的问题：

(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面__________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的__________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，常用的酶是__________。

(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现________________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成____________细胞，这种细胞的黏着性__________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量__________。

(3)用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)检查某种有毒物质是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂到________期的细胞用显微镜进行观察。

(5)在细胞培养过程中，通常在________________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中__________的活性降低，细胞新陈代谢的速率很低。

(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤当作________进行攻击。

解析：(1)在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶处理可以使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来。(2)随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞，这种细胞的细胞膜表面糖蛋白减少，细胞的黏着性降低。(3)由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。(4)由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此最好选用分裂到中期的细胞用显微镜观察染色体数目。(5)由于在冷冻(或超低温、液氮)条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率很低，通常在此条件下保存细胞。(6)机体把移植的皮肤当作抗原攻击，会发生免疫排斥反应现象。

答案：(1)相互接触　接触抑制　单层(或一层)　胰蛋白酶　(2)衰老甚至死亡　不死性　降低　减少　(3)活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色(或死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色)　(4)中　(5)冷冻(或超低温、液氮)　酶　(6)抗原

2．下图是通过两种途径制备抗体的流程图。请回答下列问题：

(1)过程①表示__________，细胞乙称为____________，其特点是______________________________。

(2)过程④需要________酶，过程⑥需要用________处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使该细胞处于一种____________________________的生理状态。

(3)抗体1的特点是____________________________________________；抗体1、2空间结构不同的原因是_________________________________________________________。

(4)若要检测过程⑥中导入的目的基因是否转录出了mRNA，检测方法是________________。

解析：(1)图中过程①表示小鼠骨髓瘤细胞和免疫后产生的B细胞(浆细胞)的融合过程。细胞乙增殖后能产生大量抗体，所以细胞乙是杂交瘤细胞，其特点是既能无限增殖，又能产生专一抗体。(2)过程④表示以mRNA为模板获得目的基因的逆转录过程，需要逆转录酶。过程⑥表示将基因表达载体导入受体细胞，需要用Ca^2＋处理大肠杆菌使之成为能够吸收DNA分子的感受态细胞。(3)抗体1是单克隆抗体，它的特点是特异性强、灵敏度高，并可以大量制备。大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，所以抗体1、2空间结构不同。(4)检测目的基因是否转录出mRNA的方法是分子杂交技术。

答案：(1)细胞融合　杂交瘤细胞　既能无限增殖，又能产生专一抗体　(2)逆转录　Ca^2＋　能够吸收周围环境中DNA分子　(3)特异性强、灵敏度高，并可以大量制备　抗体2形成过程中没有经过内质网和高尔基体的加工，抗体1形成过程中经过内质网和高尔基体的加工(合理即可)　(4)分子杂交技术

布置作业

课时、专题练习十二

课后反思